簡述酶聯(lián)免疫斑點檢測ELISpot將細(xì)胞培養(yǎng)與免疫檢測原理相結(jié)合實現(xiàn)了在單細(xì)胞水平對細(xì)胞因子分泌頻率的直接定量分析。該技術(shù)能夠從數(shù)十萬個細(xì)胞中檢測出單個分泌目標(biāo)因子的細(xì)胞在疫苗免疫應(yīng)答評價、感染性疾病監(jiān)測及腫瘤免疫研究中具有不可替代的價值。一、ELISpot的技術(shù)原理與工作流程一細(xì)胞因子原位捕獲ELISpot實驗在預(yù)包被了特異性捕獲抗體的PVDF微孔板中進(jìn)行。將待測細(xì)胞如外周血單核細(xì)胞或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞與特定刺激物抗原肽段、絲裂原等共孵育后活化的細(xì)胞在局部環(huán)境中分泌細(xì)胞因子這些因子隨即被孔底緊鄰的捕獲抗體立即結(jié)合。二免疫酶學(xué)放大與斑點形成洗去細(xì)胞后加入生物素標(biāo)記的檢測抗體針對不同表位的二抗形成捕獲抗體-細(xì)胞因子-檢測抗體夾心復(fù)合物。隨后加入酶標(biāo)記的親和素如堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素在底物如BCIP/NBT作用下酶催化反應(yīng)在抗體結(jié)合位點附近形成不溶性紫色沉淀最終產(chǎn)生一個清晰可辨的斑點。三結(jié)果判讀與定量每個斑點代表一個分泌該細(xì)胞因子的細(xì)胞。通過人工計數(shù)或自動斑點分析系統(tǒng)可獲得每孔中陽性斑點的總數(shù)從而計算出分泌目標(biāo)細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率如每百萬細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)。二、ELISpot相比ELISA的核心優(yōu)勢一功能層面的本質(zhì)不同ELISA通過顯色反應(yīng)測定上清液中積累的可溶性蛋白總量反映的是分泌了多少而ELISpot直接可視化單個細(xì)胞分泌行為回答的是有多少細(xì)胞在分泌。這一區(qū)別在疫苗免疫應(yīng)答監(jiān)測中尤為重要——關(guān)鍵指標(biāo)是抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量而非每個細(xì)胞分泌的絕對量。二單細(xì)胞水平的超高靈敏度ELISpot能從20萬至30萬細(xì)胞中檢出1個分泌特定細(xì)胞因子的細(xì)胞這一靈敏度遠(yuǎn)高于ELISA檢測下限通常在皮摩爾級。常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子需細(xì)胞活化數(shù)小時并可能因細(xì)胞通透處理丟失信號ELISpot實時捕獲分泌的細(xì)胞因子更真實反映細(xì)胞功能。三動態(tài)功能信息的高效獲取與僅提供轉(zhuǎn)錄本豐度的RNA檢測技術(shù)不同ELISpot直接測量蛋白質(zhì)水平的細(xì)胞效應(yīng)功能且以單細(xì)胞頻率為計量單位為評估疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫提供了量化指標(biāo)。三、ELISpot的關(guān)鍵實驗要點一捕獲抗體的選擇與預(yù)包被高質(zhì)量、高親和力、低內(nèi)毒素的捕獲抗體是確保特異性和低背景的基礎(chǔ)。預(yù)包被需均勻且充分避免邊緣效應(yīng)。二細(xì)胞數(shù)量的優(yōu)化與刺激條件細(xì)胞接種密度的確定需保證孔底單層分布。刺激物抗原肽、多克隆刺激劑或特異性抗原的濃度、孵育時間和溫度需根據(jù)實驗?zāi)康暮图?xì)胞類型進(jìn)行預(yù)實驗優(yōu)化。三斑點顯色的控制與背景管理顯色反應(yīng)需精確掌控時長過度顯色會導(dǎo)致背景升高或斑點融合。設(shè)陰性對照無刺激物和陽性對照多克隆刺激劑是監(jiān)控實驗條件的基本要求。四、ELISpot的典型應(yīng)用場景一疫苗免疫應(yīng)答評價在艾滋病疫苗、乙肝疫苗、腫瘤疫苗等研發(fā)中ELISpot被廣泛用于檢測抗原特異性T細(xì)胞頻率是評估疫苗免疫原性的核心指標(biāo)之一。二感染性疾病研究ELISpot可用于結(jié)核感染診斷T-SPOT.TB技術(shù)即基于ELISpot原理通過檢測結(jié)核特異性抗原刺激下釋放IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量輔助診斷潛伏性結(jié)核感染。此外在病毒性肝炎、HIV感染等研究中ELISpot也被用于監(jiān)測特異性T細(xì)胞應(yīng)答的動態(tài)變化。三腫瘤免疫與細(xì)胞治療在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞研究和CAR-T細(xì)胞治療中ELISpot用于評估效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤抗原的特異性反應(yīng)強(qiáng)度。雙色或FluoroSpot技術(shù)可同時檢測同一細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-2提供更豐富的功能表型信息。